中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所功能生物大分子和生物檢測(cè)學(xué)科組發(fā)展了一個(gè)全新的核酶細(xì)胞內(nèi)分子間篩選策略：以一個(gè)毒性蛋白（IbsC）為報(bào)告基因，在大腸桿菌中通過核酶對(duì)其mRNA的剪切來調(diào)節(jié)毒蛋白的表達(dá)——如果核酶活性較低，IbsC可有效表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡；當(dāng)核酶具有較高活性時(shí)，毒性蛋白的表達(dá)下降細(xì)菌則可以在篩選平板上生長(zhǎng)出菌落（如圖1A）。因此在錘頭核酶的催化活性中心和突環(huán)處引入隨機(jī)突變建立篩選文庫(kù)（圖1B），經(jīng)過多輪篩選，通過基于毒蛋白的篩選策略成功獲得多個(gè)錘頭核酶突變克隆（圖1C），隨后通過測(cè)序獲得了10個(gè)具有活性的錘頭核酶突變體。
圖1（A）核酶的細(xì)胞內(nèi)篩選策略；（B）篩選庫(kù)設(shè)計(jì)；（C）篩選結(jié)果。
由于基于毒蛋白的篩選體系難于定量分析篩選出來的核酶在細(xì)胞內(nèi)的剪切效率，他們隨后設(shè)計(jì)了一個(gè)基于雙熒光蛋白的報(bào)告體系來定量對(duì)比不同核酶之間的剪切效率（圖2A）。用紅色熒光蛋白的基因替換毒蛋白基因作為報(bào)告基因，通過改變核酶的底物結(jié)合序列使得核酶靶向紅色熒光蛋白的mRNA,同時(shí)融合表達(dá)了綠色熒光蛋白的基因作為內(nèi)參，可以通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)菌紅色熒光相對(duì)綠色熒光的降低程度來評(píng)估核酶在細(xì)胞內(nèi)的敲降效果。雙熒光報(bào)告體系結(jié)果表明，篩選的核酶中有三個(gè)突變體（TX-2，TX-5，TX-9）比野生型核酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)的靶基因的敲降效果更好（圖2B），其中TX-2對(duì)紅色熒光的敲降效率是野生型核酶的2倍。為確定核酶對(duì)靶基因的剪切是否在不同的RNA序列上的通用性，他們又選擇了紅色熒光蛋白上另外兩個(gè)位置進(jìn)行剪切，TX-2在三個(gè)剪切位置對(duì)靶基因的敲降效果表現(xiàn)出了穩(wěn)定一致的高效催化活性（圖2C和D）。
圖2. 錘頭核酶HHRz對(duì)大腸桿菌紅色熒光蛋白基因的敲降
由于TX-2是在原核細(xì)胞中獲得，隨后考察了TX-2在真核細(xì)中的基因的敲降能力: 首先在癌細(xì)胞Hela中對(duì)比了篩選獲得的核酶對(duì)紅色熒光蛋白的敲降效率，結(jié)果表明TX-2的敲降效果顯著好于野生型核酶；隨后，以斑馬魚的體細(xì)胞色素沉著基因（nacre）為核酶的靶標(biāo)，研究核酶在動(dòng)物模型上對(duì)特定內(nèi)源基因的敲降（圖3）。結(jié)果表明，注射表達(dá)TX-2質(zhì)粒的斑馬魚與野生型核酶注射的魚相比，體細(xì)胞色素沉著明顯減少，RT-PCR的結(jié)果也表明TX-2會(huì)引起nacre基因在RNA水平上顯著減低（圖3A）。又以斑馬魚的尾部發(fā)育基因（ntl）為靶標(biāo)進(jìn)一步驗(yàn)證TX-2的敲降效率，結(jié)果表明TX-2比野生型核酶具有更好的靶基因敲降效果（圖3B），注射TX-2核酶導(dǎo)致超過27%的斑馬魚出現(xiàn)典型的無尾表型。這些結(jié)果說明TX-2可以作為一個(gè)有效的工具用于細(xì)胞內(nèi)的基因敲降。
圖3 （A）TX-2對(duì)斑馬魚紅色熒光蛋白基因的敲降；（B）（C）TX-2對(duì)斑馬魚nacre基因（控制色素沉著）的敲降；（D）TX-2對(duì)斑馬魚ntl基因（控制尾部發(fā)育）的敲降
綜上所述，通過體內(nèi)篩選方法得到的核酶TX-2無論在原核還是在真核細(xì)胞內(nèi)都表現(xiàn)出比野生型錘頭核酶更好的基因敲降效果，說明基于毒蛋白的細(xì)胞內(nèi)篩選體系完全適于催化分子間核酶工具的進(jìn)化和篩選，同時(shí)通過體內(nèi)篩選獲得的活性大大增強(qiáng)的突變型錘頭核酶，目前用腺相關(guān)病毒為載體利用，TX-2作為新的分子工具在癌癥的基因治療研究工作已經(jīng)在該研究團(tuán)隊(duì)展開。
該研究的主體工作由中國(guó)科學(xué)院成都生物所黃鑫博士完成，整個(gè)研究工作歷時(shí)四年的時(shí)間，同時(shí)感謝四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的莫顯明教授和趙永云博士對(duì)該研究工作的支持與幫助，該研究結(jié)果已發(fā)表在2019年 Nucleic Acids Research （IF: 11.561）上。